實(shí)現(xiàn)生物體樣本深層成像

SeeDB

實(shí)現(xiàn)生物體樣本深層成像

　　今井猛博士等人開(kāi)發(fā)了一種對(duì)于水溶性生物體組織的形態(tài)和組成在不破壞熒光蛋白以及熒光神經(jīng)示蹤劑的條件下,可快捷簡(jiǎn)便地使大腦等生物體組織透明化的方法——SeeDB（See Deep Brain）。SeeDB 由水、果糖、還原劑構(gòu)成。

　　SeeDB 法是在使用共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)顯微鏡下可深層成像的方法。可利用熒光蛋白和神經(jīng)示蹤劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光神經(jīng)回路的全貌闡明和定量分析等各種各樣的應(yīng)用。

詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)點(diǎn)擊 SeeDB 技術(shù)開(kāi)發(fā)者今井猛博士的網(wǎng)站：SeeDB Resources（本部分內(nèi)容亦可參見(jiàn)相關(guān)資料）

◆SeeDB protocol 案例

　　SeeDB 法，可用于脊椎動(dòng)物的各種組織，下面以小鼠大腦為例進(jìn)行介紹。

１．固定

①將小鼠大腦在4%多聚甲醛/PBS，4℃下固定過(guò)夜。

②樣本用PBS清洗三次（每次清洗10分鐘）

２．透明化處理

③　將樣本加入放有20 mL的SeeDB:20 w/v%果糖溶液的50 mL錐形瓶中。

　　在室溫下在旋轉(zhuǎn)器中旋轉(zhuǎn)4-8小時(shí)（約4 rpm）

　　在脆弱的樣本和薄片情況也可以用壓板式搖床（約17 rpm）

④　將樣本加入放有SeeDB:40 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)4-8小時(shí)。

⑤　將樣本加入放有SeeDB:60 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)4-8小時(shí)。

⑥　將樣本加入放有SeeDB:80 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)12小時(shí)。

⑦　將樣本加入放有SeeDB:100 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)12小時(shí)。

⑧　將樣本加入放有SeeDB的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)24小時(shí)。

   　最長(zhǎng)時(shí)間可延長(zhǎng)至48小時(shí)。在透明化成功時(shí)，透光可觀察到組織透明化。

３．觀察

⑨　將SeeDB處理過(guò)的大腦樣本置于共聚焦顯微鏡或雙光子激發(fā)顯微鏡下觀察。

（注意點(diǎn)）

　　樣本用SeeDB液固定。用SeeDB透明化處理后的樣本折射率可達(dá)到1.49。因此，物鏡中應(yīng)該有甘油浸沒(méi)透鏡、油鏡、透明化用鏡片，即使浸水鏡頭到達(dá)2 mm深度也是沒(méi)有問(wèn)題的。浸沒(méi)式鏡片請(qǐng)使用浸沒(méi)液，SeeDB不能用作浸沒(méi)液。在使用干式鏡頭（折射率1.0）和浸水鏡頭（折射率1.33）獲取畫(huà)像情況下，需要補(bǔ)正深度值（補(bǔ)正值請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)）。

SeeDB　處理案例

SeeDB生物體樣本透明化

左起依次為經(jīng)SeeDB液透明化處理的小鼠幼胎（幼胎12天）

新生鼠（生后3天）的全腦、成鼠大腦（8周齡，厚度2 mm）

SeeDB　觀察案例

雙光子激發(fā)顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠

（10周齡）大腦熒光成像

使用Olimpus公司產(chǎn)品

多光子專用物鏡：XLSLPLN25XGMP觀察案例

比例尺：100 μm

小鼠大腦固定后用Dil標(biāo)記，SeeDB透明化處理案例   

左：嗅球僧帽細(xì)胞樹(shù)突（橫向觀察）

右：嗅球僧帽細(xì)胞樹(shù)突（縱向觀察）

使用Olympus公司產(chǎn)品

有機(jī)硅浸沒(méi)型物鏡：UPLSAPO 20X觀察案例。比例尺：100 μm。

組織透明化配套耗材：成像用透明室